Mirus公司最新推出的適用于臨床前研究和早期臨床實驗中大規模生產重組腺相關病毒和慢病毒轉染試劑TransIT-VirusGEN®SELECT Transfection Reagent面世了，TransIT-VirusGEN®系列轉染試劑旨在提高載體DNA轉染到懸浮和貼壁HEK293細胞的轉染效率，并增加重組腺相關病毒和慢病毒的產量。并可提供BSE TSE Statement 和質量控制的相關文件，以簡化輔助材料的資質認證過程，節省時間和成本，確保從研發到大規模生產的無縫銜接，成為臨床前研究和早期臨床實驗中大規模生產重組腺相關病毒/慢病毒的理想工具。
產品特點：
高效轉染DNA，適用于臨床前研究和早期臨床實驗中重組腺相關病毒
和慢病毒的大規模生產；
質控嚴格，包括產品性能、批次重復性、無菌性、內毒素及支原體含
量測試；
靈活性好，兼容不同的病毒生產平臺并且允許重復過濾；
無動物源成分，保證全合成制劑成分清晰。
驗證實例：
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| 圖1. TransIT-VirusGEN® Reagent和 VirusGEN® AAV Transfection Kit能產生更高的AAV滴度。 A.在Expi293 Expression Media(Thermo Fisher)中生長的Expi293F細胞(Thermo Fisher)使用TransIT-VirusGEN®轉染試劑(1.5:1 reagent-to-DNA ratio (vol:wt), Mirus Bio LLC)，VirusGEN®AAV轉染試劑盒(Mirus Bio LLC)，PEIpro (1:1，Polyplus)和FectoVIR®-AAV (1:1, Polyplus)的瞬時 轉 染 來 產 生 重 組 AAV2。AAV2是 通 過 轉 染 pAAV-hrGFP、pAAV-RC和 pAAV-Helper質 粒(1:1:1的DNA比例，每瓶2 μg/ml-2 mg，Agilent Technologies)產生的。1L的2×106細胞/ml密度在2.8L 的Thomson shake flask中轉染。在轉染后72小時使用化學裂解收獲AAV2。通過轉導HT1080細胞來測定功能性滴度，并在轉導后48小時使用Guava®easyCyte 5HT流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。用少于20% GFP陽性細胞的病毒稀釋液測量AAV功能滴度。基因組拷貝通過使用引物和靶向CMV啟動子的 探針的ddPCR測 定 。B. 使 用 AAV2 Titration ELISA Kit(Progen)測定總組裝衣殼，通過將基因組拷貝數除以每種條件下的總組裝衣殼來確定GC/capsid ratio。誤差線代表duplicate flasks的范圍。 | 圖2. 在不同的懸浮細胞類型和培養基配方中TransIT-VirusGEN® Reagen和VirusGEN®AAV Transfection Kit在AAV生產中的表現優于基于PEI的試劑。(A) Expi293F細胞(ThermoFisher)或(B)病毒生產細胞(ThermoFisher)在轉染前適應或生長在Expi293培養基 (Thermofisher)、LV-MAX (Thermofisher)、FreeStyle™ F17 (ThermoFisher)或BalanCD HEK293 (Irvine Scientific)培養基。使用TransIT-VirusGEN®轉染試劑(2:1reagent-to-DNA ratio (vol:wt)(體 積 :重 量 )， Mirus Bio LLC)，VirusGEN® AAV Transfection Kit(Mirus Bio LLC)的 AAV生 產 與 PEIpro (1:1reagent-to-DNA ratio(vol:wt)，Polyplus)和PEI MAX (2:1reagent-to-DNA ratio (vol:wt)，Polysciences)進行比較。AAV2是通過轉染pAAV-hrGFP、pAAV-RC和pAAV-Helper質粒(1:1:1 DNA比例，1.5μg/ml = 3μg/孔，Agilent Technologies)產生的。細胞以200萬細胞/ml的細胞密度轉染。收獲的病毒用于轉導HT1080細胞，并在轉導后48小時使用Guava® easyCyte™5HT流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。用少于20% GFP陽性細胞的病毒稀釋液測量AAV功能滴度。誤差線代表重復孔的范圍。 |
 | 圖3. TransIT-VirusGEN® Reagent和VirusGEN® LV Transfection Kit在多種慢病毒包裝系統方面優于基于PEI的試劑。使用TransIT-VirusGEN®轉染試劑 +/-將 VirusGEN® LV Enhancer與 PEIpro (2:12:1 reagent-to-DNA ratio，Polyplus)和PEI MAX (4:12:1 reagent-to-DNA ratio，Polysciences)進行比較。慢病毒是通過用兩種不同的LV載體混合物(1μg/ml，2μg/ml)轉染在Expi293表達培養基(Thermo Fisher)中生長的Expi293細胞而產生的，包括:(A)第三代載體pALD-LentiEGFP-A轉移載體和pALD-VSV-G-A、pALDRev-A、pALD-GagPol-A包 裝 載 體 (3:0.5:0.5:2 DNA比 例 ， Aldevron)或(B)第 三 代 載 體 pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP™ transfer vector(MilliporeSigma) 和 ViraSafe™ Pantropic Packaging mix (pRSV-Rev,pCMV-VSV-G, pCgpV, CellBio Labs) 以 3:0.5:0.5:2 DNA比例轉染。在轉染后18小時，將VirusGEN® LV Enhancer加入到TransIT-VirusGEN®中。含病毒的上清液用于轉導293T/17細胞，并在轉導后72小時使用Guava®easyCyte™ 5HT流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。慢病毒功能滴度是從含有少于20%GFP陽性細胞的病毒稀釋液中測定的。誤差線代表重復孔的范圍。 |
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| 圖4. TransIT-VirusGEN® Reagent和VirusGEN® LV Transfection Kit可與多種細胞系和培養基配方兼容，用于在懸浮293細胞中生產慢病毒。在LV-MAX生產培養基(ThermoFisher)中生長的病毒生產細胞(293-VP)、在Expi293表達培養基(ThermoFisher)中生長的Expi293細胞或在FreeStyle™F17 (ThermoFisher)中生長的FreeStyle™ 293-F細胞在轉染前以4×10^6細胞/ml接種(2ml/未處理的6孔 板 )。使用 TransIT-VirusGEN 轉 染 試 劑 +/- VirusGEN LV Enhancer(Mirus Bio，3:1 reagent-to-DNA ratio(wt:vol))生產慢病毒。通過以3:0.5:0.5:2的DNA比例(Aldevron，25μg/瓶(1μg/ml最終濃度 ))轉染第三代載體 ALD-LentiEGFP-A轉移載體和 pALD-VSV-G-A、pALD-RevA、pALD-GagPol-A包裝載體來生產慢病毒。轉染后18小時加入 VirusGEN® LV Enhancer。在轉導 293T/17細胞后，測量含病毒上清液的功能滴度，并在轉導后72小時，使用Guava easyCyte™5HT流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。慢病毒功能滴度是從含有少于 20% GFP陽性細胞的病毒稀釋液中測定的。誤差條代表三個孔的標準偏差。 | 圖5. TransIT-VirusGEN轉染試劑可以多次過濾且對試劑性能沒有影響。 (A)使用在FreeStyle™ F17培養基中生長的懸浮FreeStyle™ 293-F細胞生產慢病毒，并用第三代載體pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP轉移載體(Sigma)和ViraSafe™ Pantropic Packaging mix (pRSV-Rev, pCMV-VSV-G, pCgpV, Cell Bio Labs)以 3:0.5:0.5:2的DNA比例轉染，總質粒1ug/ml，使用TransIT-VirusGEN轉染試劑(3:1，體積:重量)，TransIT-VirusGEN® Transfection Reagent (3:1, vol:wt)通 過 0.22 um polyethersulfone(PES)過濾裝置(Millipore Sigma)過濾指-定次數。使用通過含病毒的上清液轉導 ® 293T/17細胞，并在轉導后72小時使用Guava easyCyte™ 5HT流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。 (B)AAV2是通過在FreeStyle™ F17培養基中生長的懸浮FreeStyle™ 293-F細胞產生的，使用TransIT-VirusGEN® Transfection Reagent (2:1, vol:wt)轉 染 pAAVhrGFP、pAAV-RC和 pAAV-Helper質 粒 (1:1:1DNA ratio，1.5u g/ml，AgilentT ® echnologies)。收獲的病毒用于轉導HT1080細胞，并在轉導后48小時使用Guava easyCyte™ 5HT Flow Cytometer.流式細胞儀測量綠色熒光蛋白的表達。對于慢病毒和AAV病毒，功能滴度都是從含有少于20% GFP陽性細胞的病毒稀釋液中測定的。誤差條代表三個孔的標準偏差。 |
驗證實例
| 用途 | 科研 | 臨床前和早期臨床實驗 | 后期臨床試驗和商業生產 | ||
| 名稱 | TransIT-VirusGEN®
| TransIT-VirusGEN® SELECT
| TransIT-VirusGEN® GMP
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| 成分 | 相同的TransIT-VirusGEN® 試劑配方可隨時使用，化學成分明確，不含動物源，含有77.5%乙醇 | ||||
是否提供 LV 和 AAV Enhancer Kits | 提供 | 即將推出 | 提供 | ||
| 貨號 | 名稱 | 貨號 | 名稱 | ||
| MIR 6750 | VirusGEN® AAV Transfection Kit | MIR 6815-GMP | VirusGEN® GMP AAV Transfection Kit | ||
| MIR 6760 | VirusGEN® LV Transfection Kit | MIR 6825-GMP | VirusGEN® GMP LV Transfection Kit | ||
| 質檢標準 | Functional AAV titer assay | Functional AAV titer assay Formulation Identity Appearance Sterility per USP<71> Bacterial endotoxin per USP<85> Mycoplasma per USP<63> | Validated Formulation Identity Assay Appearance Sterility per USP<71> Bacterial endotoxin per USP<85> Mycoplasma per USP<63> | ||
貨號與規格 | MIR 6703 MIR 6704 MIR 6700 MIR 6705 MIR 6706 MIR 6720 | 0.3 ml vial 0.75 ml vial 1.5 ml vial 5 x 1.5 ml vials 10 x 1.5 ml vials 30ml | MIR 6730 MIR 6735 30ml bottle (for 10 L of cell culture) 150ml bottle (for 50 L of cell culture) | MIR 6845-GMP | 150 ml bottle (for 50 L of cell culture) |
| 提供文件材料 | Certificate of Analysis Certificate of Origin | Certificate of Analysis Certificate of Origin TSE/BSE Statement | Certificate of Analysis Certificate of Origin with TSE/BSE Statement DMF Available in 2022 with Quality Agreement | ||
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